一、饮用水卫生风险评估中生物毒性检测的必要性

在江苏省各级疾控中心的饮用水卫生风险评估体系中，理化指标检测只能反映单一污染物的浓度水平，无法综合表征水中多种污染物的联合毒性效应。发光细菌法凭借检测周期短、操作简便、灵敏度高、成本可控等优势，已成为江苏各地疾控开展出厂水、末梢水、二次供水及水源地水质急性毒性快速筛查的核心技术手段。

依据《生活饮用水卫生标准》（GB 5749-2022）及江苏省饮用水健康风险评估工作要求，各级疾控中心需在枯水期、丰水期监测中同步开展生物毒性指标检测，及时识别未知污染物的综合健康风险，为饮用水污染应急处置、供水水质安全预警提供技术支撑。

二、发光细菌法检测原理与执行标准

2.1 检测原理

发光细菌（通常为费歇尔弧菌）在正常新陈代谢过程中会产生蓝绿色荧光，当接触有毒有害物质时，细菌的呼吸酶系统受到抑制，发光强度会随毒性物质浓度升高而规律性下降。通过生物毒性检测仪测定发光强度的变化率，即可定量计算水样的急性毒性水平，通常以发光抑制率和半数效应浓度（EC₅₀）表示。

2.2 执行标准

目前疾控系统主要执行以下标准规范：

• 《水质 急性毒性的测定 发光细菌法》（GB/T 15441—1995）
• 《污水生物毒性监测技术规程 发光细菌急性毒性测试 - 费歇尔弧菌法》（试行）
• 江苏省地方饮用水卫生监测技术方案相关要求

三、检测前准备工作

3.1 仪器与试剂准备

核心仪器：发光细菌法水质生物毒性检测仪、恒温培养装置、微量移液器（10μL-1000μL）、超纯水系统。
必备试剂：发光细菌冻干粉、3% 氯化钠复苏液、2% 氯化钠稀释液、氯化汞标准溶液（参比毒物）、硫代硫酸钠（中和余氯）、pH 缓冲剂。

3.2 水样采集与预处理

1. 水样采集后需 4℃冷藏保存，24 小时内完成检测，避免污染物降解影响结果；
2. 若水样含余氯，按每升水样加入1mL 10% 硫代硫酸钠溶液中和余氯；
3. 调节水样 pH 至 0-8.0 范围，强酸或强碱性水样会直接影响细菌活性，导致检测偏差；
4. 浑浊水样可经45μm 滤膜过滤后检测，避免颗粒物遮挡光路干扰发光值读数。

四、标准化操作流程分步详解

4.1 发光细菌冻干粉复苏活化

这是整个检测流程的关键步骤，细菌活性直接决定数据准确性：

1. 从 - 20℃冰箱取出冻干粉，置于室温平衡 2 分钟；
2. 按每5g 冻干粉加入 1mL 预冷 3% 氯化钠复苏液的比例，快速注入冻干粉瓶中，充分振荡混匀；
3. 复苏菌液应为均匀乳白色液体，静置后无絮凝沉淀，暗室内肉眼可见微弱蓝绿光；
4. 置于 4℃±3℃条件下复苏活化 30 分钟，复苏后菌液 4 小时内使用有效，超时需重新制备。

4.2 仪器预热与参数设置

1. 打开生物毒性检测仪电源，预热 15-30 分钟，使仪器内部光路系统稳定；
2. 设置检测温度为 20℃±1℃，反应时间 15 分钟，测试模式选择 “急性毒性检测”；
3. 仪器调零校准：放入空白对照管进行基线校准，确保初始读数稳定在仪器正常量程内。

4.3 标准曲线绘制

每次检测需同步绘制氯化汞标准曲线，用于验证细菌活性和结果定量：

1. 配制梯度浓度的氯化汞标准溶液（02mg/L-0.22mg/L，至少设置 6 个浓度点）；
2. 向各反应管中分别加入 900μL 不同浓度的氯化汞溶液，同时设置空白对照管；
3. 按固定时间间隔向各管依次加入 100μL 活化后的菌液，加液后立即混匀；
4. 准确反应 15 分钟后，依次放入检测仪测定发光强度；
5. 以氯化汞浓度为横坐标，发光抑制率为纵坐标绘制标准曲线，要求相关系数 R²≥0.99 方可进行样品检测。

4.4 水样上机检测

1. 取预处理后的水样 900μL 加入反应管，每个水样设置 2-3 个平行样，同时设置空白对照和阳性对照；
2. 按照与标准曲线完全相同的时间间隔，向各反应管加入 100μL 菌液，立即颠倒混匀；
3. 准确计时 15 分钟反应时间后，按加菌顺序依次放入检测仪测定发光强度，记录各管相对发光单位（RLU）；
4. 检测过程中保持环境温度稳定，避免强光直射反应管，防止细菌活性异常波动。

五、结果计算与毒性分级判定

5.1 发光抑制率计算

水样对发光细菌的相对发光抑制率按以下公式计算：

5.2 毒性分级标准

结合疾控系统饮用水风险评估实际，通常采用三级毒性判定标准：

• 低毒性：发光抑制率＜20%，饮用水水质生物毒性处于安全水平；
• 中等毒性：发光抑制率 20%-50%，存在一定健康风险，需加强监测并排查污染源；
• 高毒性：发光抑制率＞50%，水质急性毒性显著，需立即启动应急响应流程。

若需精确定量，可通过系列稀释水样测定不同稀释度的抑制率，计算半数效应浓度（EC₅₀），用于不同水样间的毒性水平横向比较。

六、质量控制与操作注意事项

1. 细菌活性质控：每批次检测必须同步做阳性对照，氯化汞标准溶液的 EC₅₀值应在标准规定范围内，否则判定本次检测无效；
2. 温度控制：发光细菌对温度极其敏感，整个检测过程温度偏差需控制在 ±1℃以内，夏季高温环境需配备恒温水浴装置；
3. 操作时序：加菌、混匀、上机检测的时间间隔必须严格一致，建议采用固定节拍操作，避免人为时间差导致数据偏差；
4. 试剂效期：冻干粉需全程 - 20℃冷冻保存，严禁反复冻融，开封后一次性使用；复苏液和稀释液 4℃冷藏有效期不超过 7 天。

七、在江苏疾控饮用水风险评估中的应用价值

江苏省河网密布、供水类型多样，饮用水水源受工业、农业及生活污染源影响复杂。发光细菌法生物毒性检测作为理化检测的重要补充，能够快速筛查水中未知污染物的综合毒性效应，在以下场景发挥不可替代的作用：

• 集中式供水单位出厂水常规监测，及时发现水质异常波动；
• 突发饮用水污染事件应急检测，1 小时内出具初筛结果；
• 农村饮水安全工程水质卫生学评价，保障农村供水安全；
• 二次供水、学校供水等重点场所水质风险排查。

Q&A 常见问题解答

Q1：发光细菌冻干粉复苏后发光很弱是什么原因？

A：主要有三个常见原因：一是冻干粉过期或反复冻融导致细菌失活；二是复苏液温度过高或过低，影响细菌活化效果；三是复苏液配制浓度不准确，渗透压不适宜。建议更换新批次冻干粉，使用预冷至 4℃的 3% 氯化钠复苏液严格按比例配制。

Q2：饮用水样检测时出现抑制率为负值正常吗？

A：轻微负值（-5% 以内）属于正常波动，通常由水样中含有细菌可利用的营养物质或操作误差导致，可判定为无急性毒性。若负值超过 10%，需检查空白对照是否污染、菌液活性是否异常，重新检测。

Q3：发光细菌法可以替代理化指标检测吗？

A：不能替代。发光细菌法反映的是水样综合急性毒性水平，无法识别具体污染物种类和浓度；理化检测可精准定量单一指标。两者互为补充，疾控风险评估中需结合使用，综合判定水质安全状况。

Q4：江苏地区疾控检测饮用水生物毒性必须用发光细菌法吗？

A：目前国家及江苏省饮用水监测方案中，生物毒性并非强制必测指标，但在风险评估、应急监测中推荐优先采用发光细菌法作为快速筛查手段，部分地市已将其纳入常规监测补充指标。

Q5：一次检测大概需要多长时间？

A：从样品预处理到出具结果，单批次约需 1.5-2 小时，其中细菌复苏活化 30 分钟、样品反应 15 分钟，其余为试剂配制和仪器操作时间，适合大批量水样快速筛查。

江苏某疾控中心在做饮用水卫生风险评估时，配套的发光细菌法水质生物毒性检测仪操作流程是什么？

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